当前孕期非产科的急诊手术、宫内胎儿手术及恶性肿瘤手术逐年增加[1]，孕期实施全身麻醉的病例增多。全麻镇痛和镇静药物多为脂溶性，迅速透过胎盘，到达胎儿体内，全麻药物对胎儿发育中大脑的影响程度一直是麻醉医师广泛关注的议题。吸入性全麻药物七氟烷常用于产科全麻，大量的啮齿类动物研究表明，孕中、晚期长时间或反复暴露于七氟烷，可增加子代发育中大脑的炎症反应，加速神经元凋亡，减少神经营养物质的生成，最终影响子代的神经发育并损害子代远期的学习记忆能力[2-3]。因此，研究如何缓解七氟烷对发育中大脑的神经毒性具有重要的临床意义。
研究表明，右美托咪定可通过间接激活线粒体自噬减轻七氟烷的神经毒性[4]；辅酶Q10可通过改善线粒体和突触功能缓解七氟烷的神经毒性[5]；本课题组前期研究显示，富集环境可改善七氟烷对发育中大脑的神经毒性[6]；但这些研究因缺乏强有力的证据支持，未能得到广泛认可。中医药是我国的瑰宝，姜黄素是从姜黄Curcuma longaL.根茎中提取的二苯基庚烷类化合物，具有抗肿瘤[7-8]、抗菌[9]、抗氧化[10]、抗炎[11-12]、抗呕吐[13]、抗纤维化[14]等药理作用，可透过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），通过抗氧化、抑制炎症介质释放、抑制淀粉样蛋白聚集、提高脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等神经营养物质的表达发挥神经保护作用[15]；但姜黄素能否减轻七氟烷对发育中大脑的神经毒性尚未见相关研究。因此，本研究旨在探讨姜黄素能否减轻七氟烷对发育中大脑的神经毒性。
1 材料
1.1 动物
清洁级孕19 d（gestational day 19，G19）SD母鼠32只，体质量250～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2021-0006。所有动物均饲养于南开大学实验动物观察室，温度（23±2）℃，昼夜各12 h明暗交替饲养。动物实验经南开大学实验动物福利伦理审查委员会批准（批准号2023-SYDWLL-000577）。
1.2 药品与试剂
七氟烷（批号20240112）购自上海恒瑞医药有限公司；七氟烷挥发罐购自德国Drager公司；姜黄素（批号263979，质量分数为98.16%）购自美国MCE公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号3231026004）、聚乙二醇300（批号0241801）、聚山梨酯80（批号20225003）购自北京索莱宝科技有限公司；ANNEXIN V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒（批号1031240604）购自上海碧云天生物技术有限公司；高尔基染色试剂盒（批号CR2401004）购自武汉塞维尔生物科技有限公司；BNDF抗体（批号1000227-39）、酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）抗体（批号1013655-17）购自英国Abcam公司；β-actin抗体（批号54o2802）、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（批号56j9958）购自美国Affinity公司。
1.3 仪器
CytoFLEX流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；SMART 3.0 Morris水迷宫视频跟踪系统（西班牙Panlab公司）；GL2415R型Linron系列台式高速冷冻离心机（苏州Monad生物有限公司）；FA1004LC型电子天平（常州万泰天平仪器公司）；XSP-H1600型电子显微镜（深圳奥斯微光学仪器有限公司）；伯乐电泳仪、蛋白全能转印Turbo系统快速Tans-Biot转膜仪（美国Bio-Rad公司）；天能Tanon 5200系列全自动化学发光成像系统（北京原平皓生物技术有限公司）。
2 方法
2.1 分组、造模及给药
采用随机数字表法将G19母鼠随机分为对照组、模型组和姜黄素低、高剂量（20、40 mg/kg）组，每组8只。除对照组外，其余各组母鼠吸入2.5%七氟烷6 h，实施全麻的孕鼠麻醉结束、翻正反射恢复后，置于50%氧气中20 min。所有孕鼠饲养至自然分娩。姜黄素溶解于0.07 mL DMSO、0.28 mL聚乙二醇300、0.035 mL聚山梨酯80和0.315 mL生理盐水中，子代出生后21 d，各给药组子代ip相应剂量的药物（0.7 mL/只），对照组和模型组子代ip等体积的生理盐水，连续注射3周。
2.2 Morris水迷宫实验检测子代学习记忆能力
各组子代出生后36～41 d于水迷宫中进行行为学测试。前5 d为定位航行实验，每天于4个象限各训练1次，每次限时60 s。超过60 s未找到平台者，由训练者引导至平台并适应10 s，提前到达平台者则允许适应2 s。以第5天4个象限成绩平均值作为定位航行实验结果；第6天撤去水下平台，进行空间探索实验，以离平台最远象限为入水点。以逃避潜伏期（即从入水点到找到平台所用时间，超过60 s认为逃避潜伏期为60 s）、穿越平台次数来评价子代的学习和空间记忆能力。
2.3 流式细胞术检测子代海马CA1区神经元细胞凋亡情况
Morris水迷宫实验结束后，全麻处死子代大鼠，取双侧海马组织，生理盐水冲洗后，迅速放入4 ℃预冷的PBS溶液中。取出组织，放入DMEM高糖培养基中，充分研磨后，离心弃上清。加入红细胞裂解液后充分裂解，离心弃上清。PBS漂洗后，加入1×Binding Buffer，加入AnnexinV-FITC，摇匀后室温避光孵育。加入PI，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
2.4 Western blotting检测子代海马CA1区神经元BDNF和TrkB蛋白表达
取子代大鼠海马组织，经研磨机研磨后，含PMSF的RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。加入5×Loading Buffer，金属浴95 ℃使蛋白变性10 min。蛋白样品经10%、15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后加入一抗（1∶1 000），于4 ℃孵育过夜；加入二抗（1∶2 000），孵育后进行ECL显色，采用化学发光成像系统成像，以β-actin为内参，采用Image J软件分析条带灰度值。
2.5 高尔基染色检测子代海马CA1区神经元树突棘密度
取子代大鼠海马组织，切成组织块，超纯水冲掉表面血液，按试剂盒说明书，置于高尔基染色A＋B液中室温黑暗保存2周，然后换入C液，浸泡72 h，采用切片机切成100～200 μm薄片。蒸馏水冲洗切片2次，每次4 min，置于D液＋E液＋蒸馏水的混合液中10 min，然用梯度乙醇对切片进行脱水，最后无水乙醇脱水4次。于400倍显微镜下观察海马神经元，采用Image J软件测定海马神经元树突上的树突棘数量。
2.6 统计学分析
采用Graphpad Prism 9软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的资料以表示，多组间差异检验采用单因素方差分析，各组间的多重比较采用Bonferroni检验。
3 结果
3.1 姜黄素对七氟烷引发孕鼠子代海马CA1区神经元细胞凋亡的影响
如图1所示，与对照组比较，模型组和各给药组子代海马CA1区神经元细胞凋亡率均升高；与模型组和姜黄素低剂量组比较，姜黄素高剂量组神经元细胞凋亡率显著升高（P＜0.001）。
3.2 姜黄素对七氟烷引发孕鼠子代海马CA1区神经元BDNF和TrkB蛋白表达的影响
如图2所示，与对照组比较，模型组子代海马CA1区神经元BDNF和TrkB蛋白表达水平显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，姜黄素低剂量组BDNF和TrkB蛋白表达水平显著升高（P＜0.001），姜黄素高剂量组BDNF蛋白表达水平显著升高（P＜0.001）；与姜黄素低剂量组比较，姜黄素高剂量组BDNF和TrkB蛋白表达水平显著降低（P＜0.001）。
3.3 姜黄素对七氟烷引发孕鼠子代海马CA1区神经元树突棘密度的影响
如图3所示，与对照组比较，模型组子代海马CA1区神经元树突棘密度显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，姜黄素低剂量组神经元树突棘密度显著升高（P＜0.001）；与姜黄素低剂量组比较，姜黄素高剂量组神经元树突棘密度显著降低（P＜0.05）。
3.4 姜黄素对七氟烷引发孕鼠子代学习记忆能力的影响
如图4所示，在子代定位航行实验中，与对照组比较，第5天模型组子代逃避潜伏期显著延长（P＜0.001）；与模型组比较，姜黄素各剂量组子代逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05、0.001）。
如图5所示，在空间探索实验中，与对照组比较，模型组子代穿越平台所在象限时间显著缩短（P＜0.001），穿越平台所在区域次数显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，姜黄素低剂量组子代穿越平台所在象限时间显著延长（P＜0.001）；与姜黄素低剂量组比较，姜黄素高剂量组子代穿越平台所在象限时间显著缩短（P＜0.05），穿越平台所在区域次数显著减少（P＜0.05）。
4 讨论
2016年美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）基于大量的动物实验结果指出，人类孕晚期重复或长时间（超过3 h）暴露于常用全麻药物，存在对胎儿发育中大脑产生神经毒性的风险[16]。因此，积极寻找预防、减轻或治疗全麻药物神经毒性的方法，是麻醉学领域急需解决的重要议题。
BDNF属于神经营养素家族，是一种脑内合成的促进神经生长发育的碱性蛋白质，在神经元活动、突触可塑性、学习和记忆形成等方面发挥重要的作用[17]。突触长时程增强（long-term potentiation，LTP）反映了突触的可塑性，是学习和记忆形成的生理学基础，BDNF与TrkB结合后参与了LTP的诱导，有助于LTP的维持[18]；BDNF与TrkB结合后可以正性调节突触前神经递质的释放概率，增加突触可塑性，正性调节认知功能[19]。七氟烷是目前产科常用的吸入性全麻药，动物实验发现孕期发育中大脑暴露于吸入性全麻药物引起的BDNF、TrkB蛋白异常表达，可能是吸入性全麻药物产生神经毒性的重要原因之一[20-21]。
姜黄素作为一种天然的多酚化合物，可增强抗氧化酶的活性，减少炎症介质的释放[22]；可通过增加环磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）反应元件结合蛋白（response element binding protein，CREB）表达，激活BDNF/CREB信号通路发挥神经保护作用，缓解酗酒引起的神经退行性变[23]；可通过增加神经营养物质如神经元素2（neurogenin 2，Ngn2）、配对盒基因6（paired box gene 6，Pax6）、神经源性分化D1（neurogenic differentiation 1，NeuroD1）和Wnt/β-catenin信号通路的表达促进海马神经发生，从而改善急性脑缺血小鼠的认知功能障碍[24]。因此，本研究观察姜黄素能否缓解七氟烷对发育中大脑的神经毒性。
本研究与课题组前期研究一致，验证了孕晚期母体长时间暴露于七氟烷对子代大脑的神经毒性[25-26]。同时，本研究发现子代大鼠给予20 mg/kg姜黄素治疗后，子代大鼠海马CA1区BDNF、TrkB蛋白表达增加，神经元树突棘密度增加；在水迷宫中的逃避潜伏期缩短、穿越平台次数增加；提示姜黄素可能通过增加BNDF、TrkB表达，改善了子代海马的神经元发育、学习能力和空间记忆能力，减轻了七氟烷对发育中大脑产生的神经毒性。姜黄素缓解发育中大脑神经毒性的作用机制可能为BDNF与TrkB结合后激活细胞内酪氨酸激酶活性，导致TrkB磷酸化，从而通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酶C-γ（phospholipase C-γ，PLC-γ）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等信号通路，引发脑cAMP-CREB的Ser133位点磷酸化，激活CREB，有利于神经元存活、分化和发育，促进树突棘形成，为突触形成和突触信息传递效率的提高提供结构基础[27]。
既往姜黄素用于幼鼠的研究较少，本研究中姜黄素ip的给药剂量主要参考了成年大鼠的相关文献[28]，其参考剂量范围为10～200 mg/kg，在该范围内的啮齿类动物模型实验中尚未见有姜黄素神经毒性的相关研究。然而，本研究中随着姜黄素剂量的提高，姜黄素高剂量组的治疗效果并未随之增加，反而出现了下降：与姜黄素低剂量组相比，姜黄素高剂量组子代海马CA1区神经元细胞凋亡率增加，BDNF、TrkB表达降低，树突棘密度、穿越平台时间和次数减少。推测姜黄素高剂量组治疗效果下降、幼鼠神经元细胞凋亡率增加的原因可能是姜黄素药物剂量过大导致。在离体细胞实验中，姜黄素在0～40 µmol/L可激活非受体酪氨酸激酶（cellular-Abelson gene，C-Abl）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路，呈剂量相关性地上调DNA损伤基因45α（growth arrest and DNA damage 45α，GADD45α）表达，促进神经胶质细胞对姜黄素的敏感性，增加DNA损伤和神经胶质细胞凋亡[29]；但随着姜黄素剂量的增加是否加速神经元凋亡，目前尚无相关报道。因此，随着姜黄素剂量增大，姜黄素高剂量组治疗效果下降的原因仍需在后续研究中证实。
综上，本研究发现孕晚期母鼠暴露于七氟烷对子代发育中大脑产生的神经毒性，可通过子鼠ip 20 mg/kg姜黄素予以缓解，其机制可能为姜黄素通过上调子代海马CA1区BDNF和TrkB表达，促进子代海马神经元发育，改善子代的学习、记忆能力。然而，40 mg/kg姜黄素有药物过量的可能，其安全有效剂量仍需进一步核实。本研究创新性地将姜黄素用于缓解七氟烷对发育中大脑的神经毒性，对于该用法相关案例或研究报道甚少。但本研究未对姜黄素可能发挥作用的BDNF/CREB等信号通路进行验证，本课题组将在后续研究中进行探索。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：张佩军，王 涵，张艳菊，贾金娥，李静宇，孙 哲，刘美玉，于志强．姜黄素对七氟烷引起发育中胎鼠大脑神经毒性的影响 [J]. 中草药, 2024, 55(18): 6269-6275.返回搜狐，查看更多
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